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형질전환 실험세트2 (GFP를 이용한 E.coli의 형질전환)
Transformation of E. coli with Green Fluorescent Protein
이 실험에서 학생들은 E.coli와 pGFP 플라스미드를 이용한 박테리아 형질전환의 생물학적 과정을 탐구합니다. 마지막 단계에서 박테리아가 형질전환을 통해 획득한 특성(항생제 내성과 형광)을 관찰하고 분석합니다.
※ 이 실험은 항생제가 포함되어 있습니다. 페니실린, 앰피실린, 카나마이신, 테트라사이신 같은 항생제에 알러지 반응이 있는 학생은 실험에 참가하지 않도록 합니다.
학교장터(S2B)번호 : 202006260881362    바로가기 


실험 가능 횟수 및 인원

  • 10조
실험소요시간

  • 준비-50분, 형질전환-15분, 인큐베이션-하룻밤 (E.coli source plate 미리 준비시)
필요장비

  • 피펫, 피펫팁, 항온수조 2개, 온도계, 인큐베이션오븐, 얼음, 마킹펜, 분젠버너, 핫플레이트 또는 전자레인지, 장갑, 장파장 UV광원
구성

  • Instructions, BactoBeads™ E. coli GFP Host, supercoiled pFluoroGreen™ plasmid DNA, ampicillin, IPTG, CaCl2, Growth Additive, ReadyPour™ Luria Broth Agar (sterile), Luria Broth Medium for Recovery (sterile), petri plates (small), petri plates (large), plastic microtipped transfer pipets, wrapped 10 ml pipet (sterile), toothpicks (sterile), inoculating loops (sterile), microcentrifuge tubes
보관

  • 일부 구성물은 냉장과 냉동 보관필요

(※ 참고 : 제품을 받으시고 실험하기 까지 장시간 보관하실 때는 BactoBead는 냉장보관, 
            냉동표시로 포장된 시약은 냉동보관 합니다.
            그 외 아이스팩에 들어있지 않은 구성품과 시약은 상온 보관입니다.)
참고영상




Troubleshooting Guide

문제점

원인

해결

소스 플레이트에서 세포 성장부족

배양시간이 너무 짧음

37에서 총 16-20시간 배양

항생제가 소스 플레이트에 들어감

플레이트에 부을 때 정확한 단계에서 항생제와 시약들을 넣었는지 확인

부정확한 배양 온도

설정된 배양기 온도를 별도의 온도센서로 측정

Satelite Colony가 형질전환 플레이트에 형성됨

부정확한 농도의 항생제

정확한 농도인지 확인

저하된 항생제

ReadyPour agar 가열 후 60까지 충분히 식히고 추가

플레이트를 너무 많은시간 배양

37에서 16-18시간 배양

플레이트의 콜로니가 지저분해 보임

형질전환체를 가진 플레이트를 너무 빨리 뒤집음

플레이트를 뒤집기 전 cell suspension이 충분히 흡수되게 함

플레이트에 물기가 너무 많음

실온에서 건조

플레이트에 콜로니가 나타나지 않음

플라스미드DNA가 형질전환 과정에서 추가되지 않음

형질전환 튜브에 추가시 정확한 피펫사용이었는지 확인

부정확한 host cell

정확한 박테리아 균주가 사용되었는지 확인

적절하지 못한 heat shock

42에서 heat shock이 정확히 90초동안 진행되었는지 확인

항생제 농도 부정확

정확한 항생제 사용

낮은 형질전환 효율

충분하지 못한 세포

소스플레이트에서 더 많은 콜로니 선택(500ulCaCl2당 15@1-2mm)

20시간 넘게 소스플레이트를 배양

20시간을 넘기지않도록 주의필요한 경우는 20시간 후에 냉장냉장여부에 상관없이 20시간 이상 배양된 소스플레이트는 사용하지 않도록함

플레이트가 너무 오래됨

형질전환 플레이트 준비 후 빠르게 사용

CaCl2에 세포가 resuspend 잘 안됨

볼텍싱으로 CaCl2에서 세포를 완전히 resuspend

CaCl2 용액이 충분히 차갑지 않음

첨가하기 전에 미리 충분히 얼음에서 10-15분간 배양, 30분이상은 하지말 것더많은 DNA가 박테리아 세포 외벽에 붙도록 하기위함

플라스미드 DNA가 너무 많거나 너무 적게 cell suspension

플라스미드의 정확한 양을 사용

적절하지 못한 heat shock

42에서 heat shock이 정확히 90초동안 진행되었는지 확인

저하된 항생제

ReadyPour agar 가열 후 60까지 충분히 식히고 추가

부정확한 농도의 항생제

정확한 농도인지 확인